光緒帝在位三十四年，然而在這三十四年里幾乎都被慈禧太后控制著，雖然親政后可以進行一些朝政的處理，但他并沒有實際的決策權。這對于希望勵精圖治拯救國家于危難的光緒帝來說是痛苦的，唯一一次幾乎是豁出去的戊戌變法最后還是被慈禧太后扼殺在搖籃中，光緒帝自己也被囚禁在瀛臺。所以說慈禧和光緒之間的矛盾在晚年是急劇上升的。更為巧合的是當時中國最為重要的兩個人物在1908年的一天幾乎同時死去，這是轟動一時的，這也讓世人們對光緒帝的死因充滿了各種猜想。

曾在宮中擔任女官的德齡女士在《清宮二年記》、《瀛臺泣血記》等書中，說是李蓮英下毒害死了光緒。鑒于德齡走的是暢銷書的模式，其作品往往拿清宮秘事嘩眾取寵，似不可信。況且，光緒從小就受李蓮英看護，一直叫他“諳達”(師傅)，并曾夸他“忠心事主”。光緒被囚瀛臺后，其它太監懾于慈禧太后的淫威，不敢對光緒多有接近，唯有李蓮英多方照顧，還經常到瀛臺與光緒帝拆裝鐘表消遣。再有一事可以佐證，八國聯軍撤出北京后，慈禧一行人在回京途中，曾在保定駐蹕。李蓮英侍候慈禧太后睡下后，隨后去光緒住處探望，只見光緒在燈前孤坐，無一太監值班。當時正是值隆冬季節，天寒地凍，光緒的房間竟然沒有鋪蓋而無法入睡。李蓮英見后抱著光緒的腿痛哭道：“奴才們罪該萬死！”然后趕緊把自己的被褥抱過來給光緒。光緒后來回憶西逃的苦楚時也曾說：“若無李諳達，我活不到今天。”由此看來，說李蓮英害死光緒似不可信。

溥儀在《我的前半生》一書中則談到，袁世凱在戊戌變法時辜負了光緒的信任，在關鍵時刻出賣了皇上。袁世凱擔心一旦慈禧死去，光緒帝決不會輕饒了他，所以就借進藥的機會，暗中下毒，將光緒帝毒死。這種說法雖貌似事出有因，但以袁世凱當時的勢力，畢竟還是難以接近宮廷，因而基本沒有可信度。

《花隨人圣庵摭憶》里也為光緒喊冤，說光緒并非善終，但其懷疑的對象卻指向了隆裕皇后和其寵信的太監小德張，而幕后的指使人可能暗指慈禧太后。隆裕皇后是慈禧的侄女，她和光緒的婚姻簡直就是一場災難。作為當時后宮中的主要人物，隆裕皇后要搞點陰謀當然不是沒有可能，但要說隆裕皇后能像她的那個姑媽那樣心狠手辣，也不可信。

光緒的體質本來就不強壯，容易神經過敏，加以早年房事過度，腰病之生，由來已久。其身體禁不住刺激，神經稍受震動，或聽到鑼鼓響聲，或受衣褲磨擦，或偶有性的刺激即行遺精，還不能經常吃補藥，越吃遺精就越頻繁。由此看來，光緒的病情是綜合征，兼有腎炎、高血壓、胃炎、肺癆等癥，諸病齊發，極難救治。

光緒對中醫并不信任，每次服中藥前都要捧藥詳細檢視。慈禧太后總跑去干涉內務府大臣關于皇帝的進食之事，光緒本聽從太醫的建議合理進食，這下又被氣得不行，當場把枕頭扔到地上以示抗議。光緒臨終前的一段時間，雖在重病中，但仍舊要每天清早前往儀鑾殿給慈禧太后請安，然后隨同到勤政殿臨朝，這種生活對于病魔纏身的光緒來說實在是一種莫大的折磨。雖然使用西醫療法后，光緒的腰痛減少，遺精也有所減少，但化驗其尿樣仍有少許蛋白質，估計其腰病還是一大隱患。

光緒正常治病有一個月后，某天光緒突然連呼腹疼，汗如雨下，捂著肚子在床上亂滾，連喊：“肚子痛的了不得！”當時正是非常之時，慈禧太后也病得快不行了，宮廷無主，亂如散沙。光緒這里無人管事，也沒有御醫，只有一位西醫屈桂庭在床前。當時對光緒病狀的判斷是：夜不能睡，便結，心急跳，神衰，面黑，舌黃黑，但最奇怪的則頻呼肚痛，這和前期的病癥似乎沒有什么關系。屈桂庭當時也覺得心里打鼓，感覺里面有問題，但也不敢多言惹禍上身。當時他能做的，就是讓讓光緒躺在床上，以毛巾施行熱敷而已。等到光緒疼痛稍緩，屈桂庭便匆匆辭去。這也是屈桂庭進宮最后一次為光緒看病，此后宮內情形和光緒病狀，屈桂庭自稱毫無所知，只聽說慶親王奕劻被召入宮，酌商擇嗣繼位的問題，沒過多久，便聽說光緒已在瀛臺涵元殿駕崩了。屈桂庭后來自己也說，光緒之死實是個難解之迷，以至斧聲燭影，人言人殊，至于怎么回事，他也說不清楚。他說的這些東西，也只能為研究者提供佐證而已。

由國家清史編纂委員會主任戴逸教授等13位專家聯合撰寫的《清光緒帝死因研究工作報告》稱，根據相關研究，常人口服砒霜60至200毫克就會中毒身亡。光緒帝攝入體內的砒霜總量明顯大于致死量。其胃腹部衣物上的砷是其含毒尸體腐敗后直接侵蝕遺留所致，而其衣領部位及頭發上的大量砷，則由其腐敗尸體溢流侵蝕所致。

中央電視臺主任編輯鐘里滿則以光緒帝臨終前參與診治的醫生親筆回憶錄及搜集到的軍機大臣的日記等為依據，進一步確定了光緒帝屬急性胃腸性砒霜中毒而亡這一結論。

至于究竟是誰將光緒置于死地，說法最多的有二種。一是背叛光緒帝的袁世凱擔心慈禧死后遭到光緒的報復，在預謀廢黜光緒帝失敗后，收買宮人下毒將其殺害。另一種，也是被認為可能性比較大的說法。是慈禧太后為了不讓自己庇護的利益受損，擔心自己死后光緒帝大刀闊斧，便在自己死前先害死了光緒帝。但不論是誰想害光緒，光緒的身體其實也已經開始不行了，光緒的死已是遲早的事情。