全面抗戰爆發，周至柔指揮國民黨空軍參戰。抗戰中，國民黨空軍曾派出飛機兩架，遠飛日本本土長崎、福岡、久留米、佐賀、九州各地，散發告日本國民黨和告日本外交協會書等傳單、小冊子共14萬份，震驚了海內外。

1937年7月7日，抗日戰爭正式爆發。不久，航空委員會正式成立空軍作戰前敵總指揮部，周至柔兼任總指揮，毛邦初為副總指揮，石邦藩任參謀長，并正式下達抗戰動員令。當時，空軍作戰部隊共十個大隊，共有各型飛機305架。

8月5日，第二大隊進駐信陽，警戒中原，相機對上海作戰;第三大隊進駐句容，警衛南京;第五大隊進駐江都，對津浦路與上海作監視作戰;第四大隊進住周家口，監視中原;第九大隊進駐信陽，相機進駐蚌埠，支援地面部隊作戰。

日軍為達到全面侵華的目的，在進攻華北同時，重兵向華東地區發動進攻。為此，日本海軍航空隊在臺灣等地布置許多遠程轟炸機和戰斗機，對中國軍隊構成嚴重威脅。周至柔奉命立即改變原作戰計劃，將空軍力量全部轉至京、滬、杭地區，阻止日軍在上海登陸，以策應南京之安全。

8月13日，上海抗戰正式打響。航委會立刻舉行緊急作戰會議，周至柔決定于次日凌晨派第五大隊掛五百磅大炸彈飛往上海，轟炸長江里的日本第三艦隊;同時令第二大隊飛往上海，分別轟炸江上日本艦隊及匯山碼頭登陸日軍與碼頭庫房。這時，在周家口的第四大隊大隊長高志航突然來到，要求參戰。他即命令高志航率隊火速趕到杭州筧橋機場。

這時長江下游地區大雨滂沱，對空軍行動極為不利。為了掌握戰機，周至柔要各飛行隊按原計劃執行。四大隊冒雨從周家口飛往筧橋，剛著陸便遇空襲警報。高志航率領隊長鄭少愚、李桂丹兩機群共27架，緊急升空作戰，分途攔截敵機。奮戰結果，擊落三架，首創空戰之光榮紀錄。這一消息，經各地電臺、報紙報道，立即傳遍全國。許多城市大放鞭炮，慶祝勝利。周至柔更是興奮不已，發表演說，勉勵空軍發揚英勇戰斗精神，再接再厲。當時許多外國記者不相信中國空軍能擊落日機，他親自帶記者們去看日機殘骸。后來，國民黨政府決定將這一天定為“空軍節”。

8月15日，敵機六十余架分批轟炸南京、杭州、嘉興、曹娥等機場，周至柔下令奮起還擊。第九大隊在曹娥上空擊落敵機4架，第四大隊在杭州上空擊落敵機16架，并協同第三、五大隊及航校暫編部隊在南京上空擊落敵機14架。16日，第四、五、三各大隊分別于杭州、句容、嘉興、南京、揚州上空截擊，共擊落敵機8架，傷數架。號稱日軍精銳的鹿屋與木更津兩海軍航空聯隊幾被殲滅。17日，空軍又主動出擊，轟炸上海敵軍司令部及其虹橋陣地，給敵軍很大打擊，擊落敵機兩架。19日，第二大隊龔穎澄、謝郁育率轟炸機，并由第四大隊李桂丹率驅逐機6架為掩護，襲擊在白龍港集結的航空母艦，結果炸沉巡洋艦一艘。

1938年春，航空委員會改組，錢大鈞擔任航委會主任，周至柔為委員兼主任參事。不久，中國自蘇聯購入一批飛機，力量稍有加強。在2月2日的南昌空戰和4月11日的武漢空戰中，與蘇聯空軍合作，又取得較大的勝利。加上1937年9月21日的太原空戰的結果，共擊落敵機115架，并俘日空軍“驅逐之王”三輪寬少佐。武漢保衛戰，又炸傷敵艦67艘、擊沉23艘。

5月19日，國民黨空軍派第十四隊隊長徐煥升率機二架，遠飛日本本土長崎、福岡、久留米、佐賀、九州各地，進行政治宣傳，并偵察日本機場及軍港情況，該機攜帶告日本國民黨和告日本外交協會書等傳單、小冊子共14萬份。目的是喚醒日本軍隊與民眾的覺悟，顯示中國軍隊的實力。國外新聞界對此紛紛報道，稱此舉“勝于炸彈”，“使日之暴行置身無地”。

是年12月中旬，桂林行營命令所部向侵占昆侖關的日軍發起總攻。空軍以柳州、桂林為基地，派第四大隊和蘇聯志愿大隊到柳州，第五大隊駐桂林，負責控制制空權，配合陸軍行動。12月17日，周至柔在桂林用電話向柳州機場下達作戰命令：“我陸軍均已就了戰斗發起線，明早八時半發起總攻，我們的飛機要在八時半以前到達昆侖關上空，掩護陸軍作戰。”

12月28日凌晨，中、蘇兩個大隊的全部飛機在柳州機場試車、試槍完畢，準備起飛。由于柳州機場接到情報電話，日本重轟炸機分三批向柳州方向飛行，柳州飛機乃于7時15分提前起飛至昆侖關上空。一小時后，敵人轟炸機由桂林回來，周至柔親自挑選的柳州空軍地面指揮官劉毅夫命令立即對敵機進行攔截。結果，鄭少愚等打下敵轟炸機6架。29日與30日，柳州空軍又數度飛往昆侖關上空，支援地面部隊作戰，直至中國軍隊攻克昆侖關

1941年4月，空軍總指揮部成立，專負作戰訓練之責，周至柔擔任總指揮，其教育長之職交給毛邦初。6月，由美國購到P-40驅逐機100架，適美國陳納德將軍組織志愿隊來中國，這些飛機即撥交其使用。此時，國民黨空軍作戰部隊仍為7個大隊。

是年12月，在第三次長沙會戰中，第二大隊擊落敵機1架、傷2架。1942年1月，國民黨空軍遠征越南，轟炸日軍在河內、菇林的機場，炸毀敵機幾十架。

這年，周至柔隨蔣介石訪問了印度。

由于美國此時補充的新飛機漸次到達，周至柔籌劃組織各大隊分派人員赴美參加高級飛行員訓練班，以及去印度卡拉奇接受美國辦的初級飛行員訓練班受訓。至年底，這些受訓人員共接收B-29轟炸機8架、P-40驅逐機27架、P-43驅逐機41架、P-66驅逐機82架，總共337架。1943年，國民黨空軍作戰部隊仍為7個大隊，另有一個混合大隊，決定采用機動集中原則，以打擊敵人。

是年5月，在鄂西會戰中，國民黨空軍分別轟炸了漢口、宜昌、沙市等機場，擊落敵機41架、炸毀6架、傷敵艦23艘。隨后，中美空軍混合團加強合作，有效地協助陸軍進行常德、豫西、長衡、桂柳等會戰，共擊落敵機216架、傷46架，擊毀地面機149架，并炸毀敵軍車400余輛、大小艦船近600艘。

同年，周圣柔隨蔣出席了開羅會議。之后，他連續獲得景星勛章和青天白日勛章。1945年5月，他當選為國民黨六屆中央執行委員，繼任軍事委員會委員長侍從室第一處主任。

這年8月，抗日戰爭勝利。10月，周至柔獲得勝利勛章。這時，國民黨空軍有第一、二、三、四、五、八、十一等7個大隊及第十二直屬中隊。年底又陸續接收美B-25、P-40、B-51等新式飛機，實力增強，裝備、速度、性能均較優良，并操控了制空權。

周至柔病逝后，臺北《中國時報》報道了這一消息，標題頗有意味：“叱咤疆場創始空軍實至名歸;縱橫球場提倡圍棋非公莫屬”